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实时 荧光定量 PCR 佰而林 qRT-PCR
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产品: 浏览次数:850实时 荧光定量 PCR 佰而林 qRT-PCR 
品牌: 佰而林
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最后更新: 2013-03-27 14:39
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详细信息

实时荧光定量PCR、RT-PCR               

 

 

实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。


1.在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
    

2.荧光域值(threshold)的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

3. Ct值与起始模板的关系

    研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

4.荧光化学  

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:

    (1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

    (2)SYBR荧光染料:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

佰而林荧光定量PCR/RT-PCR实验流程:

1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。

2. 提取 DNA/ RNA 。

3. Real Time PCR荧光定量PCR,进行实验结果分析

4. 本公司提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验资料

更多内容请看博客http://blog.sina.com.cn/biolinkcanton

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